一文读懂层析系统

在生物制药领域，下游工艺的核心任务之一就是从复杂的混合物中纯化目标分子。作为下游工艺的“主力军”，层析技术凭借其高效、精准的分离能力，已成为生物制药纯化过程中的关键工具，被广泛应用于疫苗、抗体、重组蛋白等各类生物大分子的纯化流程。

层析技术又称色谱(Chromatography)，是目前使用广泛的，同时也是可靠的蛋白质分离纯化方法。其是利用样品中不同成分的理化性质差异(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配的系数等)将样品分离的一种现代分离纯化技术。基于样品在固定相与流动相中的分配差异，从而实现目标蛋白分离纯化。该技术具有分离效率高、适用性广、易于放大等优点。

常用的层析技术主要包括5大类：凝胶过滤层析、疏水作用层析、离子交换层析、亲和层析以及反相层析。

凝胶过滤层析：也称为分子筛层析，根据分子大小进行分离。凝胶颗粒内部具有网状结构，分子大小不同的物质在层析柱中的移动速度不同，从而实现分离。

疏水作用层析：是基于分子表面疏水性的不同，利用分子和层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离物质的一种层析方式。

离子交换层析：利用物质所带电荷的不同进行分离。层析柱中的离子交换剂带有可交换的离子，与溶液中的目标物质发生离子交换反应，通过改变洗脱液的离子强度和pH值，可以将目标物质洗脱下来。

亲和层析：基于生物分子之间的特异性相互作用进行分离，如抗原与抗体、酶与底物、受体与配体等。将与目标物质具有特异性结合能力的配体固定在层析柱上，当含有目标物质的溶液通过层析柱时，目标物质与配体结合而被吸附，其他杂质则被洗脱，然后通过改变条件将目标物质洗脱下来。

反相层析：一种基于疏水相互作用的蛋白质纯化技术。在该技术中，极性较小(疏水性较强)的蛋白质或分子将优先吸附在固定相上，而极性较大(疏水性较弱)的分子则不被吸附或较早被洗脱。

图1： 常用层析技术的分离原理

近年来随着技术的进步，人们又在传统层析技术的基础上，开发了兼有多种模式的混合模式层析技术以弥补传统层析技术在某些方面的不足，其中，疏水电荷诱导层析是具代表性的新型混合模式层析技术，具有广泛的应用价值。

生物大分子分离纯化的重要问题是如何在纯化过程中保持温和的条件，从而保证蛋白质的结构和活性不受影响。层析技术为蛋白质纯化提供合适的条件，通常在室温或低温下操作，所用的流动相一般是与生理液pH值、离子强度相近的缓冲水溶液，从而保持蛋白质分子的原有构象和生物活性。纯化技术的选择与组合是对蛋白质进行成功纯化的关键，其最终目的就是经过合理设计与优化，能使获得高收率、高纯度以及低成本的目标蛋白纯化工艺。

此外，层析系统是生物药制药工艺下游纯化分离广泛使用的重要设备。层析系统主要包含层析输液系统和层析柱两个主要部分，层析柱根据结构和内径不同则可以分为手动层析柱、自动轴向压缩层析柱、自动喷胶层析柱等。

伴随着生物制药行业的快速发展，对于层析系统的要求也越来越高。尤其在当下整个行业面临着较大挑战的情况下，大家对于设备的选择也尤为慎重。稳定、安全、高效成为了很多企业在购买设备时首先考量的因素。

层析法(chromatography)又称色谱法，是利用混合物中各组分在分子亲和力、吸附力、形状、大小和分配系数等理化性质之间的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而实现组分分离的技术。

一、层析法的基本原理

层析法中有互不混溶的固定相和流动相。

固定相为固体或涂滞在固态载体表面上的液体，作为分离的基质，能与待分离的物质发生可逆的吸附、溶解等作用，它一般填充于层析柱中。

流动相是连续流动的气体或液体，它在层析柱中与固定相发生相对运动，携带待分离的组分朝着一个方向移动。

固定相填充于层析柱中(纸层析和薄层层析等除外)，在柱的顶部加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相带动下，在向前运动过程中，在流动相和固定相之间扩散传质，发生分配平衡。

溶质在固定相和流动相之间反复吸附与脱附(或溶解与挥发)，在两相间达到分配平衡，最终随流动相流出层析柱。

混合物中各组分理化性质的差异、固定相的吸附(或溶解)能力和流动相的洗脱能力是影响层析法中物质分离的主要因素。

在相同流动相和固定相中，由于各组分性质不同，从而在两相中的分配系数K有

差异，使各组分随流动相移动的速率不同，分配系数大的溶质在流动相上存在的概率小，随流动相移动速率慢，反之，分配系数小的溶质移动速率快。

当流动相带动溶质经过足够长度的层析柱时，分配系数小的溶质先流出，分配系数大的溶质后流出，从而使各组分之间得到分离，如下图所示：

层析法分离物质示意(分配系数：K组分1>K组分2>K组分3)

二、层析系统及层析基本过程

层析系统主要由以下部分构成：

①由容器、上样装置、恒流泵或恒压泵、管路和三通阀等组成的输液部分;

②由固定相、流动相和层析柱构成的分离部分;

③由紫外检测器或示差折光检测器、酸度计和电导率仪等组成的检测部分;

④由集液器和盛装容器等组成的收集部分;

④由记录仪构成的数据记录部分。

另外，有的层析系统还配备安装于计算机中，能自动控制层析系统运行，拥有记录和处理层析数据的软件系统。

将料液盛装于容器的泵入层析柱中，或者加入定量上样装置中。然后，泵入流动相，料液中的组分在层析柱中向前移动，依据组分在固定相和流动相间分配能力大小的差异，先后流出层析柱。检测器在线监测溶液中参数的变化和组分分离情况，依据检测数据分别收集目的产物和其他组分，完成分离纯化。如下图所示：

层析装置示意图

GMP生产车间中，对于层析系统，如何采取避光操作?有哪些可用的方式?

一：信息搜集

思考：问题的提问者关注如何在GMP生产操作中对层析系统(层析操作)进行避光操作，询问有哪些操作方式。这既是一个技术性问题，也涉及到法规要求。

如果产品对光敏感，比如生物制品、光敏感性药物，需要进行保护性操作以防止其发生光降解、氧化等。一些产品在光稳定性试验中显示出一定的光敏感性，那么就需要制定遮光保存要求，而这大概率也会要求进行避光或遮光生产操作要求(来自蒲公英论坛，群友提供，省局检查中要求该操作)。

那么提问者侧重于层析系统(层析操作)的避光操作，这有些技术性部分，需要考虑到层析系统的组成、层析操作过程以及层析过程所用设备/耗材/物料等。

通过信息搜集，并未搜索到专注于讲述层析系统(层析操作)避光操作的信息和资料，不过对于GMP车间内的生产操作如何避光操作有不少相关的讨论和总结，本次回答结合网络上的相关讨论以及层析系统的相关知识，给出相关建议，以供大家讨论。

二：执行建议

对于GMP车间中的层析系统(层析操作)的避光操作，可通过工程控制、操作控制和物料控制三个层面执行，具体描述如下：

1. 工程控制层面

1.1 使用不透明或遮光材料包裹/覆盖系统

比如，层析柱可以使用黑色或不透光的柱套包裹;层析管路使用不透明的管路，比如黑色、琥珀色或者覆盖有铝箔/黑色塑料套的硅胶管或特氟龙管;储罐和容器使用不锈钢容器，如果使用玻璃/透明塑料罐应配备不透明的外罩或套袋;也可以考虑为整个层析系统定制不透光的防护罩或外壳，或在设备所在区域安装遮光帘。

1.2 控制环境照明

可以考虑层析系统所在的整个房间或者在层析操作区域，安装波长安全的黄灯或红光灯(这些波长的光能量较低，不易引发光化学反应)，替代普通的白色荧光灯或LED灯。在层析运行期间，关闭操作区域上方的直接照明，仅保留必要的安全照明。要注意照度设置，比如小于40勒克斯。

有案例描述，在甲钴胺注射液生产操作中使用照度小于40勒克斯的红光照明。

2. 操作控制层面

需要明确避光步骤，比如规定从层析柱装填、平衡、上样、洗脱到收集的全过程，哪些步骤、在什么条件下(如“产品暴露时”、“收集液贮存时”)必须采取避光措施。同时规定光暴露时限，对于无法全避光的短暂操作(如连接管路、取样)，应规定最大允许暴露时间，该时间需基于产品的光稳定性研究数据。

人员操作中，要明确操作细节，例如，“所有接触产品的透明管路，在连接后应立即用铝箔包裹”;“收集瓶在灌装前应预先用不透明袋覆盖”。对操作人员进行避光重要性、具体操作方法和偏差后果的专项培训，并通过实操考核确保其能正确执行。

设计过程监控与记录，比如在生产批记录中增加避光操作确认项，要求操作人员每完成一个关键步骤后签字确认已执行避光措施。必要时，可对关键操作区域进行照度监测并记录。

3. 物料控制层面

使用避光的容器和耗材，用于层析样品的收集、取样和转运等。